如何用二氧化碳培養箱進行細胞復蘇、傳代及凍存實驗

一  復蘇 傳代

（1） 準備

   無菌超凈臺，酒精燈，75%酒精噴壺，二氧化碳培養箱，37℃水浴鍋，離心機；培養瓶，含10%胎牛血清的*培養基和基礎培養基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺使平衡到室溫），無菌工作服（白大褂），口罩，手套，記號筆

（2） 步驟

   1.穿好無菌工作服，帶上口罩和手套，快速從液氮里取出凍存管，快速放進37℃水浴鍋緩慢搖晃使細胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。

   3.開超凈臺，點燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準備），凍存管放超凈臺，換新手套，小心打開凍存管，避免污染，無菌吸管將1ml細胞全部吸出至5ml無菌EP管，補加9ml基礎培養基稀釋，1000rpm，離心5min使細胞沉淀，棄上清。

   4.加入新鮮配制的含10%血清的培養基4ml，輕輕混勻，用吸管將細胞移至25T培養瓶。

   5.平躺放置培養瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養箱培養。

   6.培養24小時后，顯微鏡觀察細胞（貼壁細胞）貼壁后，小心更換培養基，根據不同細胞的生長狀態進行傳代培養，培養瓶上標記：操作者，時間，細胞類型。

   7.有的實驗員的培養基會加入抗生素防止細胞污染，但是這對于掌握細胞培養是非常不利的，不加抗生素培養細胞更能提醒實驗者無菌操作的意識。一旦細胞出現污染，易于發現，一旦發現污染的細胞應立刻煮沸丟棄，以免污染同實驗室其他細胞。

   8.細胞長滿90%-100%即可傳代，小心打開培養瓶，瓶口過酒精燈消毒，棄培養基。

   9.加入1mlPBS，潤洗細胞，重復3次，棄PBS。

   10.加入4ml*培養基，用無菌吸管小心吹打貼壁細胞或者用胰蛋白酶消化細胞使細胞脫落。

   11.轉移1/2脫落的細胞至新的培養瓶，各瓶補加*培養基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培養瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養箱培養。

   13.待長滿后，按同樣的方法傳代培養。

二  凍存

當不需要使用細胞或者細胞量足夠時，可以將細胞凍存起來，供以后實驗用

（1） 準備

    細胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎培養液），梯度降溫盒

（2） 步驟

        1.選取活力好，密度約70%細胞用于凍存，此時細胞處于對數生長期，用于凍存。

        2 .細胞吹打或者胰酶消化后，轉移至無菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.棄上清，加入新鮮配制的細胞凍存液，25T細胞可以加入2ml細胞凍存液，分裝2個凍存管，細胞*密度為5*106-1*107個每ml。

        4.做好標記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。

        5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過夜，第二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

遵循“快速復蘇，緩慢凍存”的原則。