用恒溫培養箱進行枯草桿菌黑色變種芽孢懸液的制備

      1、以無菌操作方式開啟菌種管，加入適量營養肉湯培養基，吹吸數次，使菌種融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置 36℃±1℃ 培養 18h～24h。用接種環取第 1 代培養的菌懸液，劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，置 36℃±1℃ 培養 18h～24h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落，接種于營養肉湯培養基，置 36℃±1℃ 培養 18h～24h，即為第 3 代培養物。

      2、 用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL 第 3代～5代的 18h～24h 營養肉湯培養物，接種于羅氏瓶營養瓊脂培養基表面，將其搖動使菌液布滿培養基表面，將多余肉湯培養物吸出，羅氏瓶置 36℃±1℃ 恒溫培養箱內培養 5d～7d。

      3、用接種環取少許菌苔涂于玻片上，以改良芽孢染色法染色。改良芽孢染色法：用接種環取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通過火焰加熱將菌固定于玻片上；將涂片放入平皿內，片上放兩層濾紙，滴加足量的 5.0% 孔雀綠水溶液，將平皿蓋好，置恒溫培養箱55℃±1℃加熱 30min。取出，去濾紙，用自來水沖去殘留液；加0.5%沙黃水溶液，1min后水洗，待干后鏡檢。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。在顯微鏡（油鏡）下鏡檢，當芽孢形成率達 90% 以上時，即可進行以下處理。否則，繼續在室溫下放置一定時間，直至達到上述芽孢形成率后再進行以下處理。

      4、加 10.0mL 無菌蒸餾水于羅氏瓶中，以 L棒輕輕推刮下菌苔，吸出，再加入 5.0mL 無菌蒸餾水沖洗培養基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中，振搖 5min。

      5、將燒瓶置 45℃ 水浴 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽孢。

      6、用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除瓊脂凝塊。

      7、將芽孢懸液置無菌離心管內，以 3000r/min 速度離心 30min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，本步驟重復進行3遍。

      8、 將洗凈的芽孢懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內，80℃水浴10min（或60℃水浴30min），以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝后冷藏保存備用，有效使用期6個月。

      9、芽孢懸液在使用時，先進行活菌培養計數。

      10、 懷疑有雜菌污染時，以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑒定。